Komparatif genomik hibridizasyon

Günümüz dünyasında Komparatif genomik hibridizasyon geniş bir kitlenin büyük önem verdiği ve ilgi duyduğu bir konu haline geldi. Teknolojinin ilerlemesi ve toplumdaki sürekli değişimlerle birlikte Komparatif genomik hibridizasyon benzeri görülmemiş bir önem kazanmıştır. İnsanların günlük yaşamları üzerindeki etkisinden küresel ekonomi üzerindeki etkisine kadar Komparatif genomik hibridizasyon'in hem uzmanlar hem de vatandaşlar için bir tartışma ve düşünce konusu olduğu kanıtlandı. Bu makalede, bugün çok alakalı olan bu konu hakkında kapsamlı ve zenginleştirici bir vizyon sunmak amacıyla Komparatif genomik hibridizasyon ile ilgili farklı yönleri ve perspektifleri inceleyeceğiz.

Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), kültürleme gerektirmeden, test örneğinin DNA'sında ploidite seviyesine göre referans bir örneğe kıyasla kopya sayı varyasyonlarını (CNV'ler) analiz etmek için kullanılan moleküler sitogenetik bir yöntemdir. Bu tekniğin amacı, genellikle birbirine yakın iki kaynaktan türeyen iki genomik DNA örneğini, bütün kromozomların veya kromozom alt bölgelerinin (tüm kromozomun bir bölümü) kayıpları veya kazançları açısından farklılıklar içerdiği şüphesi nedeniyle, hızlı ve verimli bir şekilde karşılaştırmaktır. Bu teknik, başlangıçta katı tümör ve normal doku kromozom komplemanlarındaki farklılıkların değerlendirilmesi için geliştirilmiş olup,[1] kullanılan mikroskobun çözünürlüğü ile sınırlı olan giemsa bantlama ve yerinde floresan hibridizasyon (FISH) gibi daha geleneksel sitogenetik analiz tekniklerine göre 5–10 megabayt geliştirilmiş çözünürlük sunmaktadır.[2][3]

Bu, rekabetçi floresan yerinde hibridizasyon kullanılarak gerçekleştirilir. Kısaca, bu yöntem karşılaştırılacak iki kaynaktan (çoğunlukla test ve referans kaynağı) DNA'nın izole edilmesini, her DNA örneğinin farklı renklerde (genellikle kırmızı ve yeşil) floresan moleküllerle (floroforlar) bağımsız olarak etiketlenmesini, DNA'nın tek iplikli hale gelecek şekilde denatüre edilmesini ve etiketlenmiş DNA örneklerinin normal metafaz kromozom yayılımına 1:1 oranında hibridize edilmesini içerir; böylece etiketlenmiş DNA örnekleri, orijin noktasında kromozomlara bağlanır. Floresan mikroskop ve bilgisayar yazılımı kullanılarak, farklı renklerdeki floresan sinyaller her kromozom boyunca karşılaştırılır ve iki kaynak arasındaki kromozomal farklılıklar belirlenir. Bir kromozomun belirli bir bölgesinde test örneği renginin daha yüksek yoğunlukta olması, o bölgedeki materyalin ilgili kaynak örneğinde arttığını, referans örneği renginin daha yüksek yoğunlukta olması ise test örneğinde o bölgeden materyalin kaybedildiğini gösterir. Nötr bir renk (florofor etiketleri kırmızı ve yeşil olduğunda sarı) ise o konumda iki örnek arasında fark olmadığını belirtir.[2][3]

CGH, yalnızca dengesiz kromozomal anormallikleri tespit edebilir. Bunun nedeni, karşılıklı translokasyonlar, inversiyonlar veya halka kromozomlar gibi dengeli kromozomal anormalliklerin, CGH teknolojilerinin tespit ettiği kopya sayısını etkilememesidir. Ancak CGH, tek bir testte tüm 46 insan kromozomunun incelenmesine ve mikroskobik ölçekte bile silme ve çoğalmaların keşfedilmesine olanak tanır; bu durum, diğer sitolojik tekniklerle daha fazla araştırılabilecek aday genlerin belirlenmesine yol açabilir.[2]

CGH teknikleri ile birlikte DNA mikroarraylerinin kullanılmasıyla, daha özgül bir form olan array CGH (aCGH) geliştirilmiştir; bu yöntem, CNV'nin lokus bazında, 100 kilobaz gibi artan bir çözünürlükle ölçülmesine olanak verir.[4][5] Bu gelişmiş teknik, bilinen ve bilinmeyen durumların etiyolojisinin keşfedilmesini sağlar.

Tarihçe

CGH’nin geliştirilmesinin arkasındaki motivasyon, o dönemde mevcut sitogenetik analiz yöntemlerinin (giemsa bantlama ve FISH) sonuçların yorumlanmasında kullanılan mikroskoplarla sınırlı olmasından kaynaklanan potansiyel çözünürlük kısıtlamalarına dayanıyordu. Ayrıca, giemsa bantlamanın yorumlanması belirsiz olabilmekte ve bu nedenle güvenilirliği düşmekte, her iki teknik de yüksek emek gerektirdiği için incelenebilecek lokus sayısını sınırlamaktaydı.[4]

CGH analizinin ilk bildirimi, 1992’de San Francisco’daki University of California’da Kallioniemi ve çalışma arkadaşları tarafından, solid tümörlerin analizinde CGH kullanılarak yapılmıştır. Bu sonuca, tekniğin doğrudan hem meme kanseri hücre hatlarına hem de primer mesane tümörlerine uygulanmasıyla, hücreler için tam kopya numarası kariotiplerinin oluşturulması sağlanarak ulaşılmıştır. Bu şekilde, 16 farklı amplifikasyon bölgesi tanımlanmış, bunların birçoğu yeni keşifler olarak belirlenmiştir.[1]

Bunun hemen ardından, 1993 yılında du Manoir ve arkadaşları neredeyse aynı metodolojiyi rapor ettiler. Yazarlar, tekniği test etmek amacıyla bir DNA kütüphanesinden elde edilen bireysel insan kromozomlarını, farklı oranlarda iki farklı florofor kullanarak boyamış; ayrıca, CGH’yi Down sendromu veya T-hücre prolinfositik lösemi hastalarından elde edilen genomik DNA ve renal papiller karsinom hücre hattı hücreleri üzerinde uygulamışlardır. Elde edilen floresan oranlarının doğru olduğu ve farklı hücre tiplerine ait genomik DNA arasında farklılıkların tespit edilebildiği sonucuna varılmış, böylece CGH’nin son derece yararlı bir sitogenetik analiz aracı olduğu ispatlanmıştır.[6]

Başlangıçta, CGH teknolojisinin yaygın kullanımı zordu çünkü protokoller standart değildi; bu durum özellikle verilerin yorumlanmasındaki belirsizlikler yüzünden tutarsızlıklara yol açıyordu.[3] Ancak, 1994 yılında detaylı, kolay anlaşılır bir protokolü açıklayan bir derleme yayınlandı[7] ve görüntü analiz yazılımı ticari olarak kullanıma sunuldu; böylece CGH dünya çapında kullanılabilir hale geldi.[3] Yeni DNA ürünlerinin üretilmesi için mikrodiseksiyon ve dejeneratif oligonükleotid primerli polimeraz zincir reaksiyonu (DOP-PCR) gibi tekniklerin ortaya çıkmasıyla, CGH kavramının daha küçük kromozomal anormalliklere uygulanması mümkün olmuş ve böylece CGH’nin çözünürlüğü geliştirilmiştir.[3]

Geleneksel metafaz kromozom hazırlığı yerine DNA mikroarraylerinin kullanıldığı array CGH’nin uygulanması, 1997’de Solinas-Tolodo ve arkadaşları tarafından tümör hücreleri kullanılarak[8] ve 1998’de Pinkel ve çalışma arkadaşları tarafından meme kanseri hücreleri kullanılarak öncülük edilmiştir.[9] Bu, İnsan Genom Projesi sayesinde insan genomunun her yerindeki bilinen konumlara sahip klonlanmış DNA fragmanlarından oluşan bir kütüphanenin oluşturulmasıyla mümkün hale gelmiştir; bu fragmanlar DNA mikroarraylerinde problar olarak kullanılmıştır.[10] Günümüzde, cDNA, genomik PCR ürünleri ve bakteriyel yapay kromozomlar (BAC'ler) gibi çeşitli kökenlerden gelen problar, 2 milyona kadar prob içerebilen DNA mikroarraylerinde kullanılabilmektedir.[10] Array CGH, otomatikleştirilmiş olup, prob büyüklükleri metafaz hazırlıklara göre çok daha küçük olduğundan geleneksel CGH’ye göre (100 kb’ye kadar çözünürlük) daha yüksek çözünürlük sağlamakta, daha az DNA miktarı gerektirmekte, gerekirse belirli kromozomal bölgelere yönelik çalışmalara olanak tanımakta ve sıralı olduğu için analiz süresini kısaltarak tanısal amaçlara çok daha elverişli hale gelmektedir.[10][11]

Temel Yöntemler

Dosya:CGH schema.jpg
Şekil 1. CGH protokolünün şematik gösterimi

Metafaz slayt hazırlığı

Slayttaki DNA referans örneğidir ve bu nedenle karyotip açısından normal bir erkek veya kadından elde edilir; ancak, kadınların iki X kromozomuna sahip olmaları, erkek Y kromozomundan çok daha fazla genetik bilgi içerdiği için tercih edilmektedir. Bu işlemde, fitohemaglutinin ile uyarılmış periferik kan lenfositleri kullanılır. 1 mL heparinle muamele edilmiş kan, 10 mL kültür ortamına eklenir ve %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de 72 saat inkübe edilir. Hücreleri mitozda durdurmak için kolşisin eklenir, ardından hücreler hasat edilir, hipotonik potasyum klorür ile muamele edilir ve 3:1 metanol/asetik asit karışımında sabitlenir.[3]

Hücre süspansiyonundan bir damla, yaklaşık 30 cm mesafeden etanol ile temizlenmiş bir slayta damlatılmalıdır; ideal olarak bu işlem oda sıcaklığında, %60–70 nem oranında gerçekleştirilmelidir. Slaytlar, faz kontrast mikroskobu kullanılarak görselleştirilerek değerlendirilmelidir; minimal sitoplazma gözlemlenmeli, kromozomlar üst üste gelmemeli, 400–550 bant uzunluğunda olmalı, ayrık kromatitler bulunmamalı ve nihayetinde parlak yerine koyu görünmelidir. Slaytlar, oda sıcaklığında bir gece boyunca hava ile kurutulmalı ve sonraki depolama, her biri içinde silika boncukları veya kuruluğu sağlamak için azot bulunan dörtlü gruplar halinde −20 °C'de yapılmalıdır. Hibridizasyon değişken olabileceği için farklı donörlerden örnekler test edilmelidir. Ticari olarak temin edilebilen slaytlar kullanılabilir, ancak her zaman önceden test edilmelidir.[3]

Isolation of DNA from test tissue and reference tissue

Standart fenol ekstraksiyonu, test veya referans (karyotipik olarak normal birey) dokusundan DNA elde etmek için kullanılır; bu, eşit miktarlarda tris-etilendiamintetraasetik asit ve fenolün sulu DNA ile birleştirilmesini içerir. Bu işlem, çalkalama ve santrifüj ile ayrım yapıldıktan sonra, sulu tabakanın çıkarılması, eter ile ek işlem uygulanması ve nihayetinde DNA'nın yoğunlaştırılması için etanol presipitasyonu ile devam eder.[3]

Ayrıca, afinitesi kolona dayalı ticari DNA izolasyon kitleri kullanılarak da tamamlanabilir.[3]

Öncelikle, DNA taze veya dondurulmuş dokudan ekstrakte edilmelidir çünkü bunlar en yüksek kalitededir; ancak, uygun prosedürler uygulandığı sürece formalin ile sabitlenmiş veya parafin mumuna gömülü arşiv materyali kullanmak da artık mümkündür. CGH deneyinde 0,5-1 μg DNA yeterlidir; istenen miktar elde edilemezse DNA'yı çoğaltmak için DOP-PCR uygulanabilir. Bununla birlikte, bu durumda DOP-PCR'nin hem test hem de referans DNA örneklerine uygulanması, güvenilirliğin artırılması açısından önem taşır.[3]

DNA etiketleme

Nick translation, DNA'nın etiketlenmesinde kullanılır ve bu işlem; DNA'nın kesilmesi ve doğrudan etiketleme için floroforlarla etiketlenmiş nükleotidlerin ya da dolaylı etiketleme amacıyla sonradan florofor konjuge antikor eklenebilecek şekilde biotin veya oksigenin etiketli nükleotidlerin yerine geçmesinden oluşur. Daha sonra, optimum hibridizasyon için test ve referans DNA fragman uzunluklarının 500 kb ile 1500 kb arasında olup olmadığının jel elektroforezi kullanılarak kontrol edilmesi önemlidir.[3]

Bloklama

Etiketlenmemiş Life Technologies Corporation'ın Cot-1 DNA'sı (tekrarlayan dizilerle zenginleştirilmiş, uzunluğu 50bp-100bp olan plasenta DNA'sı), normal tekrarlayan DNA dizilerini engellemek amacıyla eklenir. Bu diziler özellikle sentromerler ve telomerlerde bulunur; çünkü tespit edildiklerinde floresans oranını azaltarak kâr veya kayıp oluşumlarına neden olabilir ve bu da tespit edilmelerini engelleyebilir.[3]

Hibritizasyon

Etiketlenmiş test DNA'sı ile etiketlenmiş referans DNA'sından her biri 8–12 μl karıştırılır ve 40 μg Cot-1 DNA eklenir, ardından çökeltilir ve 6 μl hibritizasyon karışımında çözülür. Bu karışım, DNA erime sıcaklığını düşürmek için %50 formamid ve etkili prob konsantrasyonunu arttırmak için %10 dektran sülfat içeren, pH 7.0'daki salin sodyum sitrat (SSC) çözeltisini içerir.[3]

Lam ve probların denatürasyonu ayrı ayrı gerçekleştirilir. Lam, 72 °C'de 5–10 dakika süreyle %70 formamid/2xSSC içerisinde daldırılırken, problar 80 °C'deki su banyosunda 10 dakika süreyle denatüre edilir ve hemen ardından metafaz lam hazırlığına eklenir. Bu reaksiyon daha sonra bir lam kapakla örtülür ve nemli bir odada 40 °C'de iki ila dört gün bekletilir.[3]

Daha sonra lam kapağı çıkarılır ve oda sıcaklığında 2xSSC kullanılarak üç, 45 °C'de 0.1xSSC ile bir ve oda sıcaklığında TNT kullanılarak birer olmak üzere 5’er dakikalık yıkamalar uygulanır. Reaksiyon daha sonra 10 dakika ön inkübasyona tabi tutulur; ardından 37 °C'de 60 dakikalık inkübasyon, TNT ile üç adet daha 5 dakikalık yıkama ve oda sıcaklığında 2xSSC ile bir yıkama uygulanır. Lam, ardından kromozom tayini için DAPI (0.35 μg/ml) ile kontrast boyama yapılıp bir lam kapağı ile kapatılmadan önce %70/%96/%100 oranında etanol serisi kullanılarak kurutulur.[3]

Floresans Görüntüleme ve Görselleştirme

Görüntüleme için, DAPI boyası ve kullanılan iki floresan bileşiğine uygun filtrelere sahip bir floresans mikroskobu gereklidir. Bu filtreler, dar bant geçiren filtreler gibi, floresan bileşikler arasındaki parazit sinyali (crosstalk) etkisini en aza indirecek şekilde tasarlanmalıdır. Mikroskobun kromatik varyasyon olmaksızın uniform aydınlatma sağlaması, doğru şekilde hizalanması ve apokromatik "plan" tipinde, x63 veya x100 büyütme oranı sunan bir objektife sahip olması gerekmektedir.[3]

Görüntü, örnek seviyesinde en az 0,1 μm uzaysal çözünürlüğe sahip ve minimum 600x600 piksel boyutunda bir görüntü verebilen bir kamera kullanılarak kaydedilmelidir. Ayrıca, kamera görüntüyü en az 5–10 saniye entegre edebilmeli ve minimum 8 bit fotometrik çözünürlüğe sahip olmalıdır.[3]

Görüntü işleme aşaması için ticari olarak temin edilebilen özel CGH yazılımları kullanılmaktadır. Bu yazılımlar, arka plan gürültüsünü çıkarmak, kromozomal kökenli olmayan materyalleri ayırıp segmentlere ayırmak, floresans oranını normalize etmek, etkileşimli kariotipleme ve kromozomların standart uzunluğa göre ölçeklendirilmesini gerçekleştirmek için gereklidir. Yüksek kaliteli çeşitli metafazların oranlarının ortalaması alınarak ve bu ortalamalar bir ideogram üzerinde (bantlama desenlerine göre kromozomların tanımlandığı diyagram) çizilerek, kromozomal silinme veya amplifikasyon bölgelerini gösteren bir "göreceli kopya sayısı kariotipi" oluşturulur. Oran profillerinin yorumlanması, sabit veya istatistiksel eşik değerler (güven aralıkları) kullanılarak yapılır. Güven aralıkları kullanıldığında, floresans oranının %95’i 1.0 değerini içermiyorsa, bu durum kazanç veya kayıp olarak tanımlanır.[3]

Ek notlar

DNA içeren herhangi bir adımın, özellikle test DNA'sıyla çalışılan adımların kontaminasyondan korunmasına son derece özen gösterilmelidir; çünkü örneğin normal DNA'nın örneğe karışması, sonuçların 1.0'a daha yakın değere kaymasına ve böylece anormalliklerin tespit edilememesine neden olabilir. Sonuçları doğrulamak için FISH, PCR ve akış sitometrisi deneyleri kullanılabilir.[4][12]

Dizi Karşılaştırmalı Genom Hibritizasyonu

Dizi karşılaştırmalı genom hibritizasyonu (ayrıca mikroarray tabanlı karşılaştırmalı genom hibritizasyonu, matrix CGH, array CGH, aCGH olarak da bilinir), genom çapında ve yüksek çözünürlüklü ölçekte kromozomal kopya sayısı değişikliklerinin tespiti için kullanılan moleküler sitogenetik bir tekniktir.[13] Array CGH, hastanın genomunu referans genomla karşılaştırır ve iki genom arasındaki farkları belirler; bu sayede, geleneksel CGH'de kullanılan rekabetçi floresan in situ hibritizasyon prensipleriyle hastada genomik dengesizlik bölgeleri saptanır.

Array CGH'nin tanıtılmasıyla, konvansiyonel CGH'nin en büyük sınırlaması olan düşük çözünürlük sorununun üstesinden gelinmiştir. Array CGH'de, metafaz kromozomları, tam olarak kromozomal konumları bilinen +100–200 kb'lık klonlanmış DNA parçalarıyla değiştirilir. Bu yöntem, aberrasyonların daha ayrıntılı bir şekilde tespit edilmesine olanak sağlamakla kalmaz, aynı zamanda değişikliklerin doğrudan genom dizisine yerleştirilmesini mümkün kılar.[14]

Array CGH, DNA kopya sayısı değişikliklerinin analizi için kullanılan diğer yöntemlere kıyasla önemli avantajlara sahip, özgül, duyarlı, hızlı ve yüksek verimli bir teknik olduğunu kanıtlamıştır; bu da onun tanısal uygulamalara daha uygun hale gelmesini sağlamaktadır. Bu yöntem kullanılarak, 5–10 kilobaz DNA dizisi seviyesinde kopya sayısı değişiklikleri tespit edilebilmektedir.[15] 2006 itibarıyla, yüksek çözünürlüklü CGH (HR-CGH) array'lerinin bile 200 bp çözünürlükte yapısal varyasyonları (SV) tespit etmede doğru olduğu gösterilmiştir.[16] Bu metot, insan kanseri ve kromozomal aberrasyonlara bağlı doğum kusurları gibi durumlarda, mikrodeletiyonlar ve duplikasyonlar gibi yeni tekrarlayan kromozom değişikliklerinin tanımlanmasını sağlamaktadır.

Metodoloji

Şekil 2. Array-CGH protokolü

Array CGH, konvansiyonel CGH ile aynı prensibe dayanmaktadır. Her iki teknikte de referans (veya kontrol) örneğinden alınan DNA ile test (veya hasta) örneğinden alınan DNA, iki farklı floresan bileşiği ile farklı şekilde işaretlenir ve nükleik asit hedeflerine rekabetçi biçimde ko-hibritize edilen problar olarak kullanılır. Konvansiyonel CGH'de hedef, referans metafaz yayılımıdır. Array CGH'de ise bu hedefler, çeşitli vektörlere (örneğin, BAC’ler veya plazmitler), cDNA’lara veya oligonükleotitlere klonlanmış genomik parçalar olabilir.[17]

Şekil 2.[14] array CGH tekniğinin şematik genel görünümünü göstermektedir. Test edilecek örnekten alınan DNA, kırmızı floresan bileşiği (Cyanine 5) ile işaretlenirken, referans DNA örneği yeşil floresan bileşiği (Cyanine 3) ile işaretlenir. İki DNA örneğinin eşit miktarları karıştırılır ve array üzerinde üçlü olarak yerleştirilmiş, binlerce eşit aralıklarla dizilmiş klonlanmış DNA parçaları ya da oligonükleotitlerden oluşan bir DNA mikroarray'ine ko-hibritize edilir. Hibritizasyondan sonra, dijital görüntüleme sistemleri kullanılarak hibritize olmuş her floresan bileşiğinin göreceli floresans yoğunlukları yakalanır ve ölçülür.[17] Elde edilen floresans yoğunlukları oranı, test ve referans genomlardaki DNA dizilerinin kopya sayıları oranına orantılıdır. Eğer bir prob üzerinde floresan kromların yoğunlukları eşit ise, bu, hastanın genomunun o bölgesinin test ve referans örneklerinde eşit miktarda DNA içerdiği şeklinde yorumlanır; eğer Cy3:Cy5 oranında bir değişiklik varsa, bu, hastanın DNA'sında belirli bir genom bölgesinde kayıp veya kazanç olduğunu gösterir.[18]

Array CGH'ye Yönelik Teknolojik Yaklaşımlar

IMR32 nöroblastoma hücre hattının ACGH profili

IMR32 Nöroblastom Hücre Hattının ACGH Profili Array CGH, oldukça çeşitli teknikler kullanılarak uygulanmıştır. Bu nedenle, array CGH’nin bazı avantajları ve sınırlamaları, seçilen tekniğe bağlıdır. İlk yaklaşımlarda, BAC gibi büyük eklemli genomik DNA klonlarından üretilen diziler kullanılmıştır. BAC’lerin kullanılması, tek kopyalık değişiklikleri tespit etmek ve anormallik sınırlarını hassas bir şekilde belirlemek için yeterince yoğun sinyaller sağlar. Ancak, izole edilen BAC klonlarının ilk DNA verimi düşük olduğundan, DNA amplifikasyon teknikleri gereklidir. Bu teknikler arasında ligasyon ile aracılı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir ya da birkaç primer seti kullanılan dejenere primer PCR ve yuvarlanan daire amplifikasyonu yer alır.[19]

Diziler, cDNA kullanılarak da oluşturulabilir. Bu diziler şu anda yüksek bir mekansal çözünürlük sunmaktadır, ancak cDNA sayısı kromozomlarda kodlanan genlerle sınırlıdır ve çapraz-hibritizasyondan dolayı duyarlılıkları düşüktür.[14] Bu durum, genom çapında tek kopyalık değişikliklerin tespit edilememesine yol açar.[20]

En yeni yaklaşım, dizilerin kısa oligonükleotidlerle oluşturulmasıdır. Oligonükleotid miktarı neredeyse sonsuzdur ve işleme hızı, maliyet etkinliği ve kolaylığı ile öne çıkar. Oligonükleotidler tek kopyalık değişiklikleri tespit edecek duyarlılığa sahip olmamakla birlikte, kromozom üzerinde birbirine yakın konumlandırılmış oligonükleotidlerden elde edilen oranların ortalaması, azalan duyarlılığı telafi edebilir.[21] Ayrıca, spesifik kırılma noktalarının ortaya çıkarılabileceği örtüşen problara sahip dizilerin kullanılması da mümkündür.

Tasarım Yaklaşımları

CGH uygulamaları için mikroarray tasarımında iki yaklaşım vardır: tüm genom ve hedefe yönelik.

Tüm Genom Dizileri

Tüm genom dizileri, insan genomunun tamamını kapsayacak şekilde tasarlanmıştır. Genellikle, genom genelinde geniş kapsam sağlayan klonlar içerirler ve diziler, genom sınırları içinde süreklilik gösteren bir örtünme sunar. Tüm genom dizileri çoğunlukla araştırma uygulamaları için inşa edilmiştir ve gen keşfinde üstün katkıları kanıtlanmıştır. Ayrıca, genomdaki DNA artışlarını ve azalışlarını benzeri görülmemiş bir çözünürlükte taramada büyük değer taşırlar.[17]

Hedefe Yönelik Diziler

Hedefe yönelik diziler, belirli bir genom bölgesini değerlendirmek amacıyla tasarlanmıştır. Bu diziler, belirli bir kromozomun veya kromozomal segmentin incelenmesi ya da mikrodelesyon sendromları veya subtelomerik yeniden düzenlemelerden şüphelenilen bireylerde belirli DNA dozaj anormalliklerini tanımlayıp değerlendirmek için tasarlanabilir. Tıp pratiğinde hedefe yönelik bir mikroarrayin temel amacı, dengesiz sitogenetik anormalliklerin teşhisi, genetik danışmanlık, prognostik değerlendirme ve klinik yönetimi için klinik olarak yararlı sonuçlar sağlamaktır.[17]

Uygulamalar

Konvansiyonel

Konvansiyonel CGH, esas olarak tümörlerde tekrarlayan şekilde kaybedilen veya kazanılan kromozomal bölgelerin tespiti ile kanserin tanı ve prognozu için kullanılmıştır.[22] Bu yaklaşım, fetal ve neonatal genomlardaki kromozomal anormalliklerin incelenmesinde de kullanılabilir. Ayrıca, konvansiyonel CGH, kromozomal anormalliklerin tespitinde kullanılabilir ve insan genetik bozukluklarıyla ilişkili karmaşık anormalliklerin tanısında etkili olduğu gösterilmiştir.[14]

Kanser Araştırmalarında

Aynı tümör tipine ait çeşitli çalışmalardan elde edilen CGH verileri, rastgele olmayan genetik anormalliklerin tutarlı örüntülerini göstermektedir.[23] Bu değişikliklerden bazıları çeşitli malign tümör türlerinde ortakken, bazıları daha tümör spesifikidir. Örneğin, lq, 3q ve 8q kromozomal bölgelerdeki artışlar ile 8p, 13q, 16q ve 17p bölgelerindeki kayıplar, meme, yumurtalık, prostat, böbrek ve mesane kanseri gibi birçok tümör türünde yaygın olarak görülür (Şekil 3). Diğer bazı değişiklikler ise testis kanserinde 12p ve Xp artışları, mesane kanserinde 13q artışı ve 9q kaybı, böbrek kanserinde 14q kaybı ve yumurtalık kanserinde Xp kaybı gibi, daha özgül olup, farklı organlardaki kanser gelişimi sırasında etkili olan benzersiz seçilim baskılarını yansıtabilir.[23] Array CGH ayrıca, kronik lenfositik lösemi gibi B hücresi malignitelerinin araştırılması ve tanısında da sıklıkla kullanılmaktadır.

Kromozomal Anormallikler

Cri du Chat (CdC), 5. kromozomun kısa kolunun kısmi silinmesi sonucu oluşan bir sendromdur.[24] Birkaç çalışma, konvansiyonel CGH’nin bu silinmeyi ve daha karmaşık kromozomal değişiklikleri tespit etmek için uygun olduğunu göstermiştir. Örneğin, Levy ve ark. (2002) CdC’nin ayırt edici özelliği olan kedi benzeri ağlamaya sahip ancak belirgin bir kariotipe sahip olmayan bir bebek rapor etmişlerdir. Yapılan CGH analizi, klinik olarak tanıyı doğrulayan 5p15.3 bölgesinden kromozomal materyalin kaybını ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, konvansiyonel CGH’nin yapısal anormallikleri tespit etmede güvenilir bir teknik olduğunu ve belirli durumlarda karmaşık anormalliklerin tanısında daha etkili olabileceğini göstermektedir.[24]

Array CGH

Array CGH uygulamaları esas olarak kanserde genomik anormalliklerin tespiti amacıyla yöneliktir. Bununla birlikte, array CGH, insan genetik bozukluklarına neden olan DNA kopya numarası anormalliklerinin analizinde de uygundur.[14] Yani, array CGH; silinmeler, amplifikasyonlar, kırılma noktaları ve ploidlik anormalliklerini ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Erken tanı, hastanın uygun tedavi ve danışmanlık almasını sağlayarak prognozunun iyileştirilmesine katkıda bulunur.[10]

Kanserde Genomik Anormallikler

Genetik değişiklikler ve yeniden düzenlemeler, kanserde sıkça görülmekte ve kanser patogenezine katkıda bulunmaktadır. Array CGH kullanılarak bu anormalliklerin tespiti, önemli kanser genlerinin konumları hakkında bilgi sağlar ve tanı, kanser sınıflandırması ve prognozlama açısından klinik kullanım alanı bulur.[17] Ancak, genetik materyalin tüm kayıplarının patojenik olmadığı, çünkü bazı DNA materyalinin immünoglobulin alt genlerinin yeniden düzenlenmesi sırasında fizyolojik olarak kaybedildiği de göz önünde bulundurulmalıdır. Yakın tarihli bir çalışmada, array CGH, myc kaynaklı onkogenez sırasında işbirlikçi genlerin belirlenmesine yol açan, fare modellerinde kromozomal aberrasyon bölgelerinin (kopya numarası varyasyonu) tespitinde uygulanmıştır.[25]

Array CGH, sadece kanserde kromozomal anormalliklerin keşfinden ziyade tümör ilerlemesinin izlenmesinde de uygulanabilir. Array CGH ile tespit edilen anormallikler sonrası FISH kullanılarak metastatik lezyonlar ile hafif lezyonların ayrımı da sağlanabilir.[5][10]

Submikroskobik Anormallikler

Prader–Willi sendromu (PWS), 15q11-13 bölgesinde paternal (babadan gelen) yapısal bir anormallik iken, aynı bölgede maternal (anneden gelen) anormallik Angelman sendromuna (AS) yol açar. Her iki sendromda da vakaların çoğunluğunun (%75) PWS/AS kritik bölgesinde 3–5 Mb’lık silinmeden kaynaklandığı gözlemlenmiştir.[26] Bu küçük anormallikler sitogenetik yöntemler veya konvansiyonel CGH kullanılarak tespit edilemez, ancak array CGH kullanılarak kolaylıkla belirlenebilir. Kanıt niteliğinde, Vissers ve ark. (2003) FISH ile doğrulanmış mikrodelesyon sendromlarına sahip üç hastayı taramak üzere 1 Mb çözünürlükte genom çapında bir dizi inşa etmişlerdir; bu üç vakada da 1.5 ila 2.9 Mb arasında değişen anormallikler kolaylıkla tespit edilmiştir.[27] Böylece, array CGH’nin submikroskobik anormalliklerin tespitinde özgül ve hassas bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir.

Ayrıca, örtüşen mikroarrayler kullanılarak, kromozomal aberrasyonlarda yer alan kırılma noktaları da ortaya çıkarılabilmektedir.

Prenatal Genetik Tanı

Henüz yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasa da, array CGH’nin preimplantasyon genetik tarama aracı olarak kullanımı giderek popülerlik kazanan bir kavramdır. Yumurtalardaki, spermlerdeki veya embriyolardaki kopya numarası varyasyonlarını (CNV) ve aneuploidi tespit etme potansiyeline sahiptir; bu durum, embriyonun başarılı bir şekilde implantasyon yapamamasına, düşük yapmasına veya Down sendromu (trisomi 21) gibi durumlara neden olabilir. Bu özellik, array CGH’yi yaşamı değiştiren durumların insidansını azaltmak ve tüp bebek (IVF) denemelerinin başarı oranlarını artırmak adına umut vaat eden bir araç haline getirmektedir. Teknik, tek bir hücreden tüm genomun amplifikasyonunu içerir ve sonrasında array CGH yönteminde kullanılır. Ayrıca, dengeli karşılıklı translokasyonlar veya Robertson translokasyonları gibi kromozomal translokasyonlar taşıyan çiftlerde, bu translokasyonların potansiyel olarak yavrularda kromozomal dengesizliklere yol açma durumunu değerlendirmek için de kullanılabilir.[12][28][29]

CGH ve array CGH'nin Sınırlamaları

Geleneksel CGH'nin başlıca dezavantajı, kopya sayısı değişiklikleri olmaksızın yapısal kromozomal aberasyonları, örneğin mozaiklik, dengeli kromozomal translokasyonlar ve inversiyonları tespit edememesidir. CGH, kazanç ve kayıpları yalnızca ploidi seviyesine göre tespit edebilir.[30] Ek olarak, kısa tekrarlayan DNA dizilerine sahip kromozomal bölgeler bireyler arasında oldukça değişkendir ve CGH analizini engelleyebilir.[14] Bu nedenle, sentromerler ve telomerler gibi tekrarlayan DNA bölgeleri, etiketsiz tekrarlayan DNA (örneğin Cot1 DNA) ile bloke edilmeli ve/veya taramadan çıkarılabilir.[31] Ayrıca, geleneksel CGH'nin çözünürlüğü, klinik uygulamalarını sınırlayan önemli bir pratik sorundur. CGH, hem kanser hem de insan genetik bozukluklarının araştırılması ve tanısında yararlı ve güvenilir bir teknik olduğunu kanıtlamış olsa da, uygulamalar yalnızca kaba anormallikleri içerir. Metafaz kromozomlarının sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, 5–10 Mb'den küçük aberasyonlar geleneksel CGH kullanılarak tespit edilemez. Bu tür anormalliklerin tespiti için yüksek çözünürlüklü bir tekniğe ihtiyaç vardır. Array CGH, bu sınırlamaların çoğunu aşar. Array CGH, yüksek çözünürlüğü ile karakterize edilir, ki bu geleneksel CGH'ye göre ana avantajıdır. Standart çözünürlük 1 ile 5 Mb arasında değişir, ancak array'e ekstra klonlar eklenerek yaklaşık 40 kb'ye kadar artırılabilir. Ancak, geleneksel CGH'de olduğu gibi, array CGH'nin ana dezavantajı, kopya sayısı değişikliklerine yol açmayan aberasyonları tespit edememesi ve mozaikliği tespit etme yeteneğinin sınırlı olmasıdır.[14] Tespit edilebilecek mozaiklik seviyesi, klonların hassasiyetine ve uzaysal çözünürlüğüne bağlıdır. Şu anda, hücrelerin yaklaşık %50'sinde bulunan yeniden düzenlemeler tespit sınırını oluşturur. Bu tür anormalliklerin tespiti için, SKY (Spektral karyotipleme) veya FISH gibi diğer teknikler hala kullanılmalıdır.[32]

Kaynakça

  1. ^ a b Kallioniemi, A; Kallioniemi OP; Sudar DA; Rutovitz D; Gray JW; Waldman F; Pinkel D (1992). "Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors". Science. 258 (5083): 818-821. doi:10.1126/science.1359641. PMID 1359641. 
  2. ^ a b c Strachan, T; Read, AP (2010). Human Molecular Genetics. Garland Science. 
  3. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r Weiss, M; Hermsen, M; Meijer, G; Van Grieken, N; Baak, J; Kuipers, E; Van Diest, P (1999). "Comparative genomic hybridization". Molecular Pathology. 52: 243-251. 
  4. ^ a b c Pinkel, D; Albertson, DG (2005). "Comparative genomic hybridization". Annu Rev Genom Hum Genet. 6: 331-354. 
  5. ^ a b de Ravel, TJ; Devriendt, K; Fryns, J-P; Vermeesch, JR (2007). "What's new in karyotyping? The move towards array comparative genomic hybridization (CGH)". European Journal of Pediatrics. 166: 637-643. 
  6. ^ du Manoir, S; Speicher, MR; Joos, S; Schröck, E; Popp, S; Döhner, H; Kovacs, G; Robert-Nicoud, M; Lichter, P; Cremer, T (1993). "Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization". Human Genetics. 90 (6): 590-610. doi:10.1007/bf00202476. PMID 8444465. 
  7. ^ Kallioniemi, OP; Kallioniemi, A; Piper, J; Isola, J; Waldman, FM; Gray, JW; Pinkel, D (1994). "Optimizing comparative genomic hybridization for analysis of DNA sequence copy number changes in solid tumors". Genes, Chromosomes and Cancer. 10: 231-243. 
  8. ^ Solinas-Toldo, S; Lampel, S; Stilgenbauer, S; Nickolenko, J; Benner, A; Döhner, H; Cremer, T; Lichter, P (1997). "Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalances". Genes, Chromosomes and Cancer. 20: 399-407. 
  9. ^ Pinkel, D; Segraves, R; Sudar, D; Clark, S; Poole, I; Kowbel, D; Collins, C; Kuo, W-L; Chen, C; Zhai, Y (1998). "High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays". Nature Genetics. 20: 207-211. 
  10. ^ a b c d e Marquis-Nicholson, R; Aftimos, S; Hayes, I; George, A; Love, DR (2010). "Array comparative genomic hybridization: a new tool in the diagnostic genetic armoury". NZ Med J. 123: 50-61. 
  11. ^ Inazawa, J; Inoue, J; Imoto, I (2004). "Comparative genomic hybridization (CGH)-arrays pave the way for identification of novel cancer-related genes". Cancer Science. 95 (7): 559-563. doi:10.1111/j.1349-7006.2004.tb02486.x. PMC 11158872 $2. PMID 15245590. 
  12. ^ a b Evangelidou, P; Alexandrou, A; Moutafi, M; Ioannides, M; Antoniou, P; Koumbaris, G; Kallikas, I; Velissariou, V; Sismani, C; Patsalis, PC (2013). "Implementation of High Resolution Whole Genome Array CGH in the Prenatal Clinical Setting: Advantages, Challenges, and Review of the Literature". BioMed Research International. 2013: Article ID 914303. doi:10.1155/2013/914303. 
  13. ^ Pinkel, D; Albertson, DG (2005). "Array comparative genomic hybridization and its applications in cancer". Nat Genet. 37 (6s): 11-17. doi:10.1038/ng1569. PMID 15920524. 
  14. ^ a b c d e f g Oostlander, AE; Meijer, GA; Ylstra, B (2004). "Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics". Clin Genet. 66: 488-495. 
  15. ^ Ren, H; Francis, W; Boys, A; Chueh, AC; Wong, N; La, P; Wong, LH; Ryan, J; Slater, HR; Choo, KH (Mayıs 2005). "BAC-based PCR fragment microarray: high-resolution detection of chromosomal deletion and duplication breakpoints". Human Mutation. 25 (5): 476-82. doi:10.1002/humu.20164. PMID 15832308. 
  16. ^ Urban, AE; Korbel, JO; Selzer, R; Richmond, T; Hacker, A; Popescu, GV; Cubells, JF; Green, R; Emanuel, BS; Gerstein, MB; Weissman, SM; Snyder, M (March 2006). "High-resolution mapping of DNA copy alterations in human chromosome 22 using high-density tiling oligonucleotide arrays". Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (12): 4534-4539. 
  17. ^ a b c d e Bejjani, BA; Shaffer, LG (2006). "Applications of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics". J Mol Diagn. 8: 528-533. 
  18. ^ Shinawi, M; Cheung, SW (2008). "The array CGH and its clinical applications". Drug Discovery Today. 13: 760-769. 
  19. ^ Fiegler, H; Carr, P; Douglas, EJ; Burford, DC; Hunt, S; Scott, CE; Smith, J; Vetrie, D; Gorman, P; Tomlinson, IP; Carter, NP (2003). "DNA microarrays for comparative genomic hybridization based on DOP-PCR amplification of BAC and PAC clones". Genes Chromosomes Cancer. 36 (4): 361-374. doi:10.1002/gcc.10155. PMID 12619160. 
  20. ^ Pollack, JR; Perou, CM; Alizadeh, AA; Eisen, MB; Pergamenschikov, A; Williams, CF; Jeffrey, SS; Botstein, D; Brown, PO (1999). "Genome-wide analysis of DNA copy number changes using cDNA microarrays". Nat Genet. 23 (1): 41-46. doi:10.1038/12640. PMID 10471496. 
  21. ^ Carvalho, B; Ouwerkerk, E; Meijer, GA; Ylstra, B (2004). "High resolution microarray comparative genomic hybridization analysis using spotted oligonucleotides". J Clin Pathol. 57 (6): 644-646. doi:10.1136/jcp.2003.013029. PMC 1770328 $2. PMID 15166273. 
  22. ^ Weiss, MM; Kuipers, EJ; Meuwissen, SG; van Diest, PJ; Meijer, GA (2003). "Comparative genomic hybridization as a supportive tool in diagnostic pathology". J Clin Pathol. 56: 522-527. doi:10.1136/jcp.56.7.522. PMID 12835287. 
  23. ^ a b Forozan, F; Karhu, R; Kononen, J; Kallioniemi, A; Kallioniemi, OP (1997). "Genome screening by comparative genomic hybridization". Trends Genet. 13 (10): 405-409. doi:10.1016/S0168-9525(97)01103-1. PMID 9352304. 
  24. ^ a b Levy, B; Dunn, TM; Kern, JH; Hirschhorn, K; Kardon, NB (2002). "Delineation of the dup5q phenotype by molecular cytogenetic analysis in a patient with dup5q/del 5p (Cri du Chat)". Am J Med Genet. 108 (3): 192-197. doi:10.1002/ajmg.10261. PMID 11891684. 
  25. ^ Aprelikova, O; Chen, K; El Touny, LH; Brignatz-Guittard, C; Han, J; Qiu, T; Yang, HH; Lee, MP; Zhu, M; Green, JE (2016). "The epigenetic modifier JMJD6 is amplified in mammary tumors and cooperates with c-Myc to enhance cellular transformation, tumor progression, and metastasis". Clin Epigenetics. 8: 38. doi:10.1186/s13148-016-0205-6. PMC 4831179 $2. PMID 27081402. 
  26. ^ L'Hermine, AC; Aboura, A; Brisset, S; Cuisset, L; Castaigne, V; Labrune, P; Frydman, R; Tachdjian, G (2003). "Fetal phenotype of Prader–Willi syndrome due to maternal disomy for chromosome 15". Prenat Diagn. 23: 938-943. doi:10.1002/pd.729. PMID 14601096. 
  27. ^ Vissers, LE; de Vries, BB; Osoegawa, K; Janssen, IM; Feuth, T; Choy, CO; Straatman, H; van der Vliet, W; Huys, EH; van Rijk, A; Smeets, D; van Ravenswaaij-Arts, CM; Knoers, NV; van der Burgt, I; de Jong, PJ; Brunner, HG; Geurts; van Kessel, A; Schoenmakers, EF; Veltman, JA (2003). "Array-based comparative genomic hybridization for the genome-wide detection of submicroscopic chromosomal abnormalities". Am J Hum Genet. 73 (6): 1261-1270. doi:10.1086/379977. PMC 1180392 $2. PMID 14628292. 
  28. ^ Fiorentino, F (2012). "Array comparative genomic hybridization: its role in preimplantation genetic diagnosis". Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 24 (4): 203-209. doi:10.1097/gco.0b013e328355854d. PMID 22729095. 
  29. ^ Lee, CN; Lin, SY; Lin, CH; Shih, JC; Lin, TH; Su, YN (2012). "Clinical utility of array comparative genomic hybridization for prenatal diagnosis: a cohort study of 3171 pregnancies". BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. 119 (5): 614-625. doi:10.1111/j.1471-0528.2012.03279.x. PMID 22313859. 
  30. ^ Weiss, MM; Hermsen, MAJA; Meijer, GA; van Grieken, NCT; Baak, JPA; Kuipers, EJ; van Deist, PJ (1999). "Comparative genomic hybridization". J Clin Pathol: Mol Pathol. 52: 243-251. 
  31. ^ du Manoir, S; Schrock, E; Bentz, M; Speicher, MR; Joos, S; Ried, T; Lichter, P; Cremer, T (1995). "Quantitative analysis of comparative genomic hybridization". Cytometry. 19: 27-41. 
  32. ^ Shaw, CJ; Stankiewicz, P; Bien-Willner, G; Bello, SC; Shaw, CA; Carrera, M; Perez Jurado, L; Estivill, X; Lupski, JR (2004). "Small marker chromosomes in two patients with segmental aneusomy for proximal 17p". Hum Genet. 115 (1): 1-7. doi:10.1007/s00439-004-1119-5. PMID 15098121.